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    質粒圖譜

    發(fā)布時間: 2024-06-24  點擊次數: 505次

    質粒圖譜為質粒DNA序列的物理圖譜,提供了包括質粒的大小、篩選標記、克隆位點、轉錄及翻譯元件等信息,為我們選擇質粒、了解質粒特點及應用提供了重 要依據。對于初學者來說該如何去閱讀質粒圖譜呢?今天來給大家講解一下如何閱讀質粒圖譜及構建質粒圖譜。


    質粒的組成要素有哪些

    1. 復制起始位點:Ori即控制復制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復制起點。而真核生物DNA分子有多個復制起始位點。

    2. 抗生素抗性基因:可以便于加以檢測,如Amp+ ,Kan+。

    3. 多克隆位點MCS:克隆攜帶外源基因片段。

    4. P/E 啟動子/增強子

    5. Terms 終止信號

    6. 加poly(A)信號:可以起到穩(wěn)定mRNA作用

    質粒圖譜


    如何閱讀質粒圖譜

    第一步:首先看 Ori 的位置,了解質粒的類型(原核/真核/穿梭質粒)。

    第二步:再看篩選標記,如抗性,決定使用什么篩選標記。

    1.Ampr 水解 β-內酰胺環(huán),解除氨芐的毒性。

    2.tetr 可以阻止四環(huán)素進入細胞。

    3.camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物,使之失去毒性。

    4.neor(kanr) 氨基糖苷磷酸轉移酶 使 G418(卡那霉素衍生物衍生物)失活。

    5.hygr 使潮霉素 β 失活。

    第三步:看多克隆位點(MCS)。

    它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入,會導致某種標志基因的失活,而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

    第四步:再看外源DNA插入片段大小。

    質粒一般只能容納小于 10 Kb 的外源 DNA 片段。一般來說,外源 DNA 片段越長,越難插入,越不穩(wěn)定,轉化效率越低。

    第五步:是否含有表達系統(tǒng)元件,即啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號。

    這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用哪種載體,還是要以實驗目的為準繩。

    啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號

    啟動子-促進 DNA 轉錄的 DNA 順序,這個 DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游,是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結合并使之開始轉錄的部位,但啟動子本身不被轉錄。

    增強子/沉默子-為真核基因組(包括真核病毒基因組)中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子-負增強子,負調控序列。

    核糖體結合位點/起始密碼/ SD 序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA 有核糖體的兩個結合位點,對于原核而言是 AUG(起始密碼)和 SD 序列。

    轉錄終止順序(終止子)/翻譯終止密碼子:結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列,此位點 down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū),這 2 部分共同構成 poly(A)加尾信號。結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列,此位點 down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū),這 2 部分共同構成 poly(A)加尾信號。


    第六步:質粒圖譜上的箭頭。

     有的箭頭順時針有的箭頭逆時針,那其實是代表兩條 DNA 鏈,即質粒是環(huán)狀雙鏈 DNA,它的啟動子等在其中一條鏈上,而它的抗性基因在另一條鏈上。


    質粒構建以及需要注意的事項:

    1.載體構建

     載體構建(vectorconstruction):載體構建是分子生物學研究常用的手段之一。主要包括已有載體多克隆位點(MCS)的改造和已有載體啟動子、增強子、篩選標記等功能元件的改造。是為把DNA分子運送到受體細胞中去,必須尋找一種能進入細胞、在裝載了外來的DNA片段后仍能照樣復制的運載體。理想的運載體是質粒(plasmid),在基因工程中,常用人工構建的質粒作為載體。載體構建即是構建含外源DNA的質粒。

     特點:當給質粒插入一段外源DNA片段后,它依然能夠進行自我復制。


    2.多克隆位點

     多克隆位點(multiple cloning site, MCS),指的是包含數個(最多20個)限制性酶切位點(restriction site)的一段很短的DNA序列。也稱為多位點接頭(polylinker),是基因工程中常用到的載體質粒的標準配置序列。MCS上含有多個單一酶切位點,是外源DNA的插入部位,每個限制性酶切位點通常是十分奇特的,即它們在一個特定的載體質粒中只出現一次。不同酶的酶切位點可有重疊。單一酶切位點就是只有一種特定的酶能夠識別并進行酶切的位點,多克隆位點一般是位于質粒上的一段序列,這段序列含有很多個酶切位點,但這些酶切位點每一個都被一種酶識別并酶切。

     

    3.質粒構建

    (1)質粒構建原理


    質粒構建是分子生物學研究中經常使用的實驗技術。原理依賴于限制性核酸內切酶,DNA連接酶和其他修飾酶的作用,分別對目的基因和載體DNA進行適當切割和修飾后,將二者連接在一起,再導入宿主細胞,實現目的基因在宿主細胞內的正確表達。


    (2)質粒構建方式

    質粒構建方式多樣,常規(guī)的T4連接酶,下面就介紹下T4連接酶構建質粒方法,T4連接酶可用于平末端也可用于粘性末端連接,但一般推薦適用黏性末端。


    (3)質粒載體的制備

    質粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切,一般推薦使用雙酶切。其實目的就只有一個,盡量使載體的末端具有特異性,防止自連。


    質粒圖譜

    圖 質粒圖譜

    4.一般目的基因用于克隆表達的情況下,酶切位點的選擇要考慮到:

       (1)選擇質粒上兩個酶切位點的距離不應小于太小(>10bp),否則影響限制性內切酶對切點的識別,不利于空載體的雙酶切;

        (2)一般目的基因用于克隆表達的情況下,酶切位點的選擇要考慮到:

    目的基因片段內部不含有所選的酶切位點(不然鑒定陽性重組子雙酶切時會將目的基因切斷)。

    (3)實驗后繼應用的所有載體(真核、原核、酵母、昆蟲)都盡可能含有所選的酶切位點。并且要保證在載體上的插入方向正確(定向克?。?。(不然換載體表達時,還要重新設計引物,以引進新的酶切位點)。

    (4)盡可能選比較常用的酶切位點(常用切點酶的價格比較便宜)。

    (5)兩個酶切點至少隔上3個堿基。

    (6)兩個酶切點最好不要是同尾酶(切下來的殘基不要互補),否則效果相當于單酶切。

    (7)最好使用酶切效率高的酶。

    (8)最好使用雙酶切有共同buffer的酶。


    注:質粒構建完成后可利用PCR原理進行測序驗證。


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